赫爾曼等(1996)采用了基于重亞硫酸鹽處理的新方法。該法靈敏度高，主要用于定性研究?；蚪MDNA采用亞硫酸氫鹽處理后，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，但胞嘧啶甲基化不變;隨后針對(duì)甲基化和非甲基化序列設(shè)計(jì)PCR引物。對(duì)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若以處理后的DNA甲基化引物為靶點(diǎn)，可獲得擴(kuò)增片段，表明其存在甲基化;反之，則表明所檢測(cè)的位點(diǎn)沒(méi)有甲基化。用途廣泛，可用于檢測(cè)特定位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。
亞硫酸氫鹽測(cè)序(BisulfitesequencingPCR,BSP)
由亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序方法(BSP),Frommer等(1992)提出的DNA甲基化研究方法，該方法具有較高的可靠性和精確度，可以確定目標(biāo)片段各CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。基因組DNA采用亞硫酸氫鹽處理后，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ窗l(fā)生甲基化的胞嘧啶沒(méi)有變化。然后設(shè)計(jì)BSP引物用于PCR，擴(kuò)增后的尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，以確定CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化，即所謂的BSP-直接測(cè)序。通過(guò)將PCR產(chǎn)物克隆到載體上進(jìn)行序列測(cè)定，可以提高測(cè)序的成功率，這種方法被稱(chēng)為BSP-序列測(cè)定法。
特點(diǎn)：高度精確，能準(zhǔn)確檢測(cè)甲基化程度百分比。
脫氧核糖核酸甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制，檢測(cè)脫氧核糖核酸甲基化意味著要用多種方法來(lái)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞DNA甲基化程度。惡性病變發(fā)展過(guò)程中，甲基化狀態(tài)并非一成不變，腫瘤細(xì)胞內(nèi)全基因組甲基化水平的降低與疾病的進(jìn)展、腫瘤的大小及惡性程度密切相關(guān)，DNA甲基化檢測(cè)對(duì)于判斷腫瘤的惡性程度具有重要意義。
檢測(cè)流程步驟
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